全面解析GST 親和層析
更新時間:2021-12-29 點擊次數:2938
谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)是生物體內的一類重要的代謝酶,參與外源和內源有毒物質的代謝。GST通過催化還原型的谷胱甘肽(GSH)和有毒物質偶聯反應,使有毒化合物的水溶性增加從而更容易排出體外,最終達到解毒的作用。利用這個原理,將GST做成標簽表達出融合蛋白,與帶谷胱甘肽配基的親和介質特異性結合,從而純化出目標蛋白,再用特異性的酶將GST標簽切除從而得到天然蛋白。
GST標簽是一種常見的標簽,它能夠增加外源蛋白的可溶性,很好地保留了蛋白的抗原性和生物活性,可在不同的宿主中表達,適應范圍廣,能夠提高外源蛋白的穩定性,可用不同的蛋白酶去除且具有高特異性,純化方便、溫和。但它也有一定的缺點,比如分子量較大,可能會影響蛋白質的功能和下游實驗,因此純化后需要去除標簽,并且如果蛋白不可溶,很難用變性的方法純化。
GST親和層析是利用GST融合蛋白與固定的谷胱甘肽(GSH)通過硫鍵共價結合,通過GSH交換洗脫的原理來進行純化。該純化柱中,凝膠手臂上通過硫鍵結合一個GSH,然后利用其與GST-tag之間酶和底物的特異性作用力,使得帶GST標簽的融合蛋白能夠與凝膠上的GSH結合,從而將標簽蛋白與其他蛋白分離開。
1.將GST Tanrose 4FF裝入合適的層析柱,層析用5倍柱體積的結合Buffer進行平衡,使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下,起到保護蛋白的作用。
2.將樣品加到平衡好的GST Tanrose 4FF中(保證目的蛋白與GST Tanrose 4FF充分接觸,提高目的蛋白的回收率),收集流出液。
3.用10-15倍柱體積的洗雜Buffer進行清洗,去除非特異性吸附的雜蛋白,收集洗雜液。
4.使用5-10倍柱體積的洗脫Buffer,收集洗脫液,即目的蛋白組分。
5.依次使用3倍柱體積的結合Buffer和5倍柱體積的去離子水平衡填料,最后再用5倍柱體積的20%的乙醇平衡,然后保存在等體積的20%的乙醇中,置于4度保存,防止填料被細菌污染。
層析柱:PreCot 5mL GST 4FF;
樣品:重組表達GST標簽蛋白;
結合緩沖液:20mM PB,150mM NaCl,pH7.4;
洗脫緩沖液:15mM還原型谷胱甘肽,50mM Tris pH8.0。
可能原因:上樣流速太快,結合時間太短。
解決方法:降低流速,保證足夠的結合時間
可能原因:緩沖液不合適,柱子平衡不到位。
解決方法:將緩沖液pH控制在3-12之間,用至少5倍的柱體積平衡柱子。
可能原因:樣品中GST融合蛋白濃度太低。
解決方法:先濃縮樣品,再進行純化。
可能原因:GST蛋白發生變性或聚集。
解決方法:選擇合適的細胞破碎方式;發生聚集時可嘗試添加1-10mM的DTT促進蛋白溶解;GST蛋白與核酸結合或蛋白之間結合時可添加適量NaCl(100-300mM)。
可能原因:洗脫強度不夠。
解決方法:增加洗脫體積數;調整洗脫緩沖液pH(8-9)或離子強度(100-300mM氯化鈉)。
可能原因:非特異性吸附。
解決方法:洗脫緩沖液中加入1%-2%Triton X-100。
可能原因:洗脫緩沖液中的谷胱甘肽被氧化了。
解決方法:洗脫緩沖液需現配現用,也可嘗試加入1-5mM的DTT。
可能原因:GST融合蛋白降解。
解決方法:加入蛋白酶抑制劑防止降解。
可能原因:在宿主細胞內表達過程中GST標簽脫落。
解決方法:嘗試更換宿主細胞或者優化序列。